PCR儀百科簡介

摘要：簡單的說，PCR*是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內InVitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。目前常用的技術，可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。根據DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類。

PCR簡介

PCR的要素

基本的PCR須具備

1.要被復制的DNA模板 Template

2.界定復制范圍兩端的引物Primers.

3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

4.合成的原料(四種脫氧核苷酸)及水。

PCR儀工作原理

利用升溫使DNA變性，用限制性內切酶使DNA雙鏈解鏈，在聚合酶的作用下使單鏈復制成雙鏈，進而達到基因復制的目的

PCR的反應包括三個主要步驟

分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱(至90~95℃)變性， 將雙股的DNA加熱后轉為單股DNA以做為復制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下(冷卻至55~60℃)附著于模板DNA兩端。 *后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下(加熱至70~75℃)進行引物的延長 Extension of primers及另一股的合成。

PCR的*早設想核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年*早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

PCR的實現

1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制

PCR的改進與完善

Mullis*初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：

①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環都要重新加。

②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物學界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：

①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。

②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。

③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度2.0Kb。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNAPolymerase。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

PCR儀的分類

普通的PCR儀

把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀，叫傳統的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運行。主要是做簡單的，對目的基因退火溫度的擴增。該儀器主要應用于科研研究，教學，學臨床，檢驗檢疫等機構。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴增可以設置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常有12種溫度梯度，這樣的儀器*叫梯度PCR儀。因為被擴增的不同DNA片段，其*適退火溫度事不同，通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增，*可以篩選出表達量高的*適退火溫度，進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節約成本的同時也節約了時間。主要用于科研，教學機構。梯度PCR儀，在不設置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。

原位PCR儀

用于從細胞內靶DNA的定位分析的細胞內基因擴增儀，如病源基因在細胞的位置或目的基因在細胞內的作用位置等。是保持細胞或組織的完整性，使PCR反應體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置上進行基因擴增，不但可以檢測到靶DNA，又能標出靶序列在細胞內的位置，于分子和細胞水平上研究疾病的發病機理和臨床過程及病理的轉變有重大的實用價值。

實時熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，*成了熒光定量PCR儀。其PCR擴增原理和普通PCR儀擴增原理相同，只是PCR擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實時結果輸出。把這PCR儀叫做實時熒光定量PCR儀(qPCR儀)。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于學臨床檢測，生物藥研發，食品行業，科研院校等機構。

獲得諾貝爾獎的PCR技術

1995年，美國科學家Mulis眾望所歸地獲得了諾貝爾化學獎，他所取得的成*是發明了PCR技術。

PCR，中文譯為聚合酶鏈式反應，其實是一種DNA的快速擴增技術，其擴增效率之高*象核裂變的“鏈式反應”那樣。PCR技術通過兩個短的稱為引物的 DNA小片段和一種耐熱的酶的作用，可以在3個小時內把特定的DNA量提高1000萬倍。這種技術一問世，立刻引起了分子生物學研究的一場革命，人們利用 這種轟動全的技術很快*把微觀領域的生物學研究大大地往前推了一步。可以這么說，PCR技術使分子生物學研究一下子獲得了突破，而且隨著PCR技術的 日趨完善，PCR在人類社會生活中的應用也越來越廣泛。比如說在“DNA指紋” 中我們提到，科學家們只需要一根頭發甚至一個細胞*可以完成DNA指紋的鑒定工作，這里實際上*要采用PCR技術，因為一個細胞中的DNA含量實在太少 了，人們根本不可能檢測到它的指紋;有了PCR技術*好辦了，通過PCR技術把這個細胞中的DNA片斷擴增1000萬倍，這樣DNA量*足夠作指紋鑒定了。 再比如，在院里檢驗血液中的某種病毒，有時病毒量極少(例如有的艾滋病病毒攜帶者)，通過傳統的檢查方法費力又費時，這時PCR技術也許*可以幫上忙。 可以先選定這種病毒DNA上的一段DNA，設計合適的引物DNA，然后通過PCR技術一擴增很快*可以判斷出血樣中是否擴增出了大量的DNA，如果是的 話，那么*說明血樣中帶有該種病毒了。PCR方法不但有極高的靈敏度，而且可以同時一次做近百個擴增反應，省時省力效率高。

PCR技術神奇*神奇在以下幾個特點上：一是被擴增的DNA所需量極小，理論上講一個分子*可以用于擴增了;二是擴 增效率高，目的基因的量成指數形式擴增，幾個小時*擴增1000萬倍以上。現在PCR技術已經被廣泛地應用于生命科學研究、食品衛生、療、法及環境監 測等諸多方面，真不愧是“獲得諾貝爾獎”的好技術!

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