檢測禽流感病毒的方法

2013年3月份，“H7N9”在上海和安徽率先發現，隨后在江蘇，浙江傳播蔓延。生物學家已經檢測出這種病毒的結構確認其毒株了。北京熙縝隆博環保科技有限公司代理的儀器會成為您的*，歡迎有意購買者撥打公司熱線電話010-68940148。

一、單鏈構型多態性(SSCP)

作為檢測基因變異的手段已得到廣泛應用，其原理是單個核苷酸的置換引起DNA單鏈構象改變,在非變性電泳中足以導致泳動率變化。

二、血清學檢測

2.1病毒中和試驗（NT） 作為經典方法，病毒中和實驗操作繁瑣、耗時、費料，臨床幾乎不用。

2.2血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗AIV 能夠與雞紅細胞發生凝集現象，這種紅細胞凝集現象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗。血凝和血凝抑制試驗可以鑒定病毒、檢測血清中的抗體水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制試驗來確定HA亞型。

2.3神經氨酸酶抑制（NI）試驗微量神經氨酸酶（NA）抑制劑抑制NA的活性，并以半抑制濃度IC50鑒定NA亞型。該方法成本低，適于大規模地應用。

2.4瓊脂凝膠擴散試驗（AGP） 用于檢測AIV共同抗原核蛋白或基質蛋白。由于所有的AIV 都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清*可對所有AIV 的抗體或抗原進行鑒定。免疫雙向擴散及免疫電泳中以沉淀線判定可以定性，免疫單輻射擴散試驗可以定量。

2.5免疫熒光技術(IFT) 將抗原或抗體標記上熒光素，再進行抗原抗體反應。*早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細胞中特異性的抗原、核蛋白(NP)或基質蛋白(MP)抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現核內熒光；用MP抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也可出現部分熒光。

2.7酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 運用ELISA原理建立的AIV檢測方法較多，如用單克隆抗體介導的、經生物素一親和素系統放大的H5亞型禽流感病毒捕獲ELISA檢測方法，為進一步研究檢測試劑盒提供基礎。AIV抗體膠體金檢測試紙條則是膠體金免疫層析分析法，用純化病毒與膠體金顆粒偶聯，吸附在玻璃纖維上制作而成，不需要其他試劑,一步完成,反應時間只需要幾分鐘(5～10min)，是一種檢測微量AIV抗體快速、簡便的方法。

三、病原學檢測

雞胚分離培養是檢測病禽組織中AIV的一種經典、準確、敏感的病原學診斷方法，可以作為金標準，特異性和敏感度均可以達到*。

四、核酸擴增方法

4.1RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守區的引物，RTPCR可以鑒定AIV。為提高擴增的靈敏度和特異性，也可采用巢式或半巢式RTPCR。

4.2多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基礎之上實現單管多檢的相對快速和經濟的檢測方法。

4.3Realtime RTPCR(RRTPCR)運用特異性的熒光水解探針的RRTPCR方法可使檢測時間縮短為4 h。Lee等建立的檢測H5、H7亞型AIV的RRTPCR方法，與傳統的培養方法比較，并以EID50（50%雞胚致病指數）為評價指標，呈正相關（r  = 0972），T 檢驗無顯著差別（P >021）。其重復性試驗呈正相關（r = 0902），靈敏度H5為1 fg或 10２ RNA拷貝，H7為10-1 fg或10 RNA拷貝，所測病毒濃度均低于1010 EID50，該靈敏度高于培養方法。

4.4依賴核酸序列的擴增（NASBA）NASBA是一種快速、等溫的RNA 擴增技術，整個反應有賴于AMV逆轉錄酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同協作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環，是以轉錄為基礎，單鏈核苷酸的連續擴增，其反應產物是單鏈RNA。擴增產物與磁珠上的捕捉探針及釕標記的電化學發光寡核苷酸探針雜交后，形成復合物，經NucliSens閱讀器直接檢測電化學發光強度。Collins等檢測了亞歐地區H5亞型AIV，同時還鑒別出高致病及低致病H5亞型。Lau 等建立的NASBA技術可以檢測H1～H15亞型的AIV，并能區分出H5及H7亞型，整個過程從核酸分離、擴增、檢測在6 h 以內，靈敏度與雞胚培養相當。

4.5環介導的等溫擴增（loopmediated isothermal amplification, LAMP）    Poon等介紹了一種新的更加簡便的擴增方法，即環介導的等溫擴增,特異性地針對6個獨立的結合位點設計兩對引物擴增，以看家基因或外源性RNA分子作為陽性對照。由于反應中產生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結果，無需凝膠電泳。作者用該方法檢測了SARS病毒后，又檢測了H1～H3的AIV，與常規方法比較符合率為*。

五、基因芯片

將RTPCR獲得的cDNA固化于芯片，利用核酸探針技術構建的檢測流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺， Cy3、Cy5標記的核酸探針與靶DNA雜交，可以進一步鑒別混合體系中擴增產物。Li等用cDNA芯片及mRTPCR對流感病毒進行檢測及分型，結果顯示cDNA芯片為基于PCR的診斷技術提供了補充，因為基于PCR的方法，直接從DNA擴增片段大小不足以證明是目的產物。

病毒分離培養和血凝抑制試驗經常作為評價新的檢測 AIV方法的對照，但病毒分離培養耗時長，至少需7 d，不利于快速診斷，病毒分離的實驗條件要求較高，同時有高致病性的危險，對毒株的檢測及管理上要嚴格考慮生物安全措施。AIV在雞胚培養過程中還可能發生發生變異。血凝及血凝抑制試驗特異性好，但其操作相對繁瑣，同時必須具備一定血凝效價的標準病毒和新鮮制備的紅細胞。血清學檢查對*后確診有回顧性診斷價值，一般只能在發病23周甚至更長時間才能有抗體陽性出現。由于 AIV 血清型眾多，新的變異株不斷出現，制備血清型特異性單克隆抗體相對困難，且在各種免疫接種的情況下，血凝抑制試驗等血清學診斷方法也會失去作用。核酸擴增技術（NAT）檢測 AIV，選擇好靶基因和引物及優化反應參數，均可獲得高靈敏度和特異性。對于血清型眾多的 AIV，不同亞型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特異地分型在 AIV 診斷中顯得尤為重要，而當前的核酸擴增技術尚不能高通量地鑒別出所有 HA 或 NA 的已知亞型。RTPCR 方法能夠獲得所有 AIV 的已知 HA 亞型，但*終結果尚需借助測序方法，不能作為常規檢測手段。要實現高通量、大規模的檢測，有望借助生物芯片這項技術。生物芯片正逐步應用于細菌及病毒的檢測，它不僅能克服 PCR 擴增技術中難題，對 PCR 擴增技術還能起到補充作用。目前人們針對病毒，甚至 AIV 檢測芯片不斷優化雜交條件；將核酸擴增產物片段化，以減少核酸二、三級結構效應對雜交的影響；以及對芯片載體結構和檢測方法進行改進，都為建立快速、靈敏、特異的 AIV 檢測方法提供平臺。